DEA 1 kan grubu tespiti için hızlı aglütinasyon testi

Köpeklerde kan grupları:

Veteriner transfüzyon tıbbı uygulaması son yıllarda önemli ölçüde arttı ve bunun sonucunda da kan gruplarının belirlenmesinin önemi daha çok dikkat çekti. Uluslararası kabul görmüş köpek kan grubu DEA (Dog Erythrocyte Antigen), köpek eritrositlerinin yüzeyinde tanımlanan spesifik antijenlere dayanır. Köpek eritrositlerinin yüzeyinde sekiz spesifik antijen tanımlanmıştır. DEA 1.1 ve 1.2, köpekteki en önemli kan faktörleridir ve DEA 1 alt grubunun bir parçası olarak kabul edilir.

Yakın tarihli bilimsel araştırmalar (immünokromatografi ve akış sitometrisine dayalı), DEA 1 alt grubunun tüm bileşenlerinin (DEA 1.1, DEA 1.2 ve muhtemelen ayrıca DEA 1.3) aslında farklı kan grupları olmadığını, kırmızı kan hücrelerinin yüzeyindeki aynı antijenin farklı ifadeleri olduğunu göstermiştir. Köpekler, farklı uyumsuz kan gruplarına karşı izo-antikorlara sahip değildir, bu nedenle başlangıçta uyumsuz bir transfüzyon genellikle iyi tolere edilir, ancak antikor üretimini uyarır. İkinci bir uyumsuz transfüzyon, ölümcül bir reaksiyona yol açabilir.

Maternal kolostrumda bulunan antikorlar, uyumsuz yavrularda neonatal hemolitik hastalığın başlangıcını belirleyebileceğinden, çiftleşmeden önce erkek ve dişinin kan gruplarını değerlendirmek gerekir.

Bir köpek DEA 1 pozitif ise, her iki tipten de kan alabilir: DEA 1 pozitif ve DEA 1 negatif. Bir köpek DEA 1 negatif ise sadece DEA 1 negatif kan alabilir. Canine Rapid-Vet-H Kit DEA 1 kullanılarak köpeğin kan grubunu belirlemek ve hayvanları DEA 1 grubuna ait pozitif veya negatif olarak sınıflandırmak mümkündür.

Test metodu

RapidVet H Dog DEA 1 kiti, yüzey zarında bir DEA 1.1 antijeni içeren bir eritrosit, polietilen kağıt üzerinde liyofilize edilmiş DEA 1'e özgü olduğu kanıtlanmış bir murine monoklonal antikoru ile etkileşime girdiğinde meydana gelen bir aglütinasyon reaksiyonuna dayanır.

Monoklonal antikor seyreltici ile sulandırılır ve hastadan alınan tam kanla iyice karıştırılır. Tüm DEA 1 pozitif eritrositler, aglütinasyona neden olan antikorla reaksiyona girer. Antikor, tüm DEA 1 negatif eritrositlerle tamamen reaktif değildir. Sonuçlar görsel olarak yorumlanır.

Uyarı - Kırmızı kan hücresi yıkaması (*):

Belirli sayıda köpek hastası, hastanın kendi kırmızı hücrelerinin aglütinasyonuna neden olan serum faktörlerine bağlı olarak değişen derecelerde oto-aglütinasyon sergiler. Bir hasta, test koşulları altında oto-aglütinasyon sergiliyorsa, testi yapmadan önce serumu ayırmadan ve kalan kırmızı hücreleri seri olarak yıkamadan bu hastanın kan grubunu kesin olarak belirlemek mümkün olmayacaktır. Kırmızı kan hücresi yıkaması, numunenin yaklaşık 2000 rpm'de 5 dakika santrifüjlenmesiyle gerçekleştirilir. Santrifüj işleminden sonra tüpte, üst sıvı kısım (plazma) ve alt katı kısım (eritrositler) elde edilir. Operatör, sıvı kısmı toplamalı ve onu aynı hacimde fizyolojik solüsyonla değiştirmelidir. Ardından operatör numuneyi tekrar karıştırarak numune almalı ve yeni bir kartta otomatik aglütinasyonun hala görünüp görünmediğini kontrol etmelidir. Eğer öyleyse, yıkama prosedürünün tekrar edilmesi gerekir. RapidVet, bu tür hastaları ayırmak için bir kuyu sağlar: “Auto-Aglütinasyon Salin Ekranı”.

Test prosedürü

1. Antikoagülan olarak EDTA ile içeren bir şırıngaya veya tüpe hastadan minimum 0,4 ml kan ÇEKİN. Test sadece 150 μl tam kan gerektirir.
    
2. Test Kartını plastik kılıfından ÇIKARIN, köpeğin adını / numarasını ve test tarihini kart üzerine YAZIN, Test Kartını düz bir yüzeye YERLEŞTİRİN.
    
3. Damlalıktan 1 damla seyrelticiyi (50 μl) “Otomatik Aglütinasyon Salin Ekranı” (Auto- Agglutination Saline Screen) işaretli kuyuya DAMLATIN.
    
4. Pipete az miktarda hasta numunesini ASPIRE EDİN ve "Otomatik Aglütinasyon Salin Ekranı" (Auto- Agglutination Saline Screen) işaretli kuyucuğa 1 damla (50 μl) bırakın. (Pipetin doğru kullanımı için Not’a bakın.).
   Bu kuyu reaktif içermez. Bir karıştırıcı kullanarak malzemeleri bu kuyunun TÜMÜNE YAYIN ve yaklaşık 10 saniye HAFİFÇE BASTIRARAK ve İYİCE KARIŞTIRARAK DAĞITIN. Hasta köpeklerin ve sağlıklı köpeklerin küçük bir yüzdesi otomatik olarak aglütine olur. Aglütinasyon gözlenirse, testi DURDURUN ve devam etmeden önce yukarıda anlatılan hücre yıkama prosedürlerini gerçekleştirin (*). "Auto- Agglutination Saline Screen" kuyucuğunda otomatik aglütinasyon gözlenmezse prosedüre devam edin.
    
5. Damlalıktan 1 damla seyrelticiyi (50 μl) diğer 2 kuyucuğa DAMLATIN. Seyreltici, liyofilize materyalin kontrol (control) ve hasta (patient) kuyucuklarının hazırlanması için gereklidir.
    
6. Pipete az miktarda hasta numunesini ASPIRE EDİN ve "Patient Test" olarak işaretlenmiş kuyucuğa 1 damla (50 μl) ve “Positive Control” olarak işaretlenmiş kuyucuğa 1 damla (50 μl) damlatın. Her bir kuyuda yeni bir karıştırıcı kullanarak malzemeleri, ilgili kuyunun TÜMÜNE yaklaşık 10 saniye boyunca, HAFİFÇE BASTIRARAK ve İYİCE KARIŞTIRARAK DAĞITIN.
    
7. Kuyucuklar arasındaki çapraz kontaminasyonu önlemeye dikkat ederek, kuyucuklardaki reaktiflerin karışmasını sağlamak için kartı yavaşça hareket ettirin.
    
8. Fazla kanın kuyuların dibinde toplanmasını sağlamak için kartı 20-30° açıyla tutun ve sonuçları 1 dakika sonra OKUYUN. "Hasta testi" (Patient Test) kuyucuğunda aglütinasyon olup olmadığını kontrol edin.
    

NOT - Pipetin kullanımı: Plastik boruyu başparmağınız ve işaret parmağınız arasında düz, kapalı uca yakın tutun, sıkıca sıkın ve basıncı serbest bırakmayın. Numune tüpünü dikey olarak tutun ve plastik tüpün açık ucunu numune yüzeyinin altına yerleştirin. Numuneyi almak için parmak basıncınızı gevşetin.

Daha sonra, pipeti doğrudan numunenin konulacağı kuyucuğun üzerinde yine dik bir konumda götürerek tutun. Yavaşça sıkın ve serbest bir damlanın kuyuya düşmesine izin verin (50 μl). Her bir pipet, karıştırıcı tarafından tutulan küçük bir numune miktarını telafi etmek için 50 μl'den biraz fazla çıkacak şekilde tasarlanmıştır.

Her pipeti yalnızca bir hasta numunesi için kullanın, ardından atın. Çapraz kontaminasyon oluşacağından ve test sonuçları yanlış olacağından, pipet hiçbir koşulda birden fazla numune için kullanılmamalıdır.

Sonuçlar:

Test doğru şekilde çalıştırıldıysa, "Positive Control" olarak işaretlenmiş kuyucukta görünür aglütinasyon oluşmuş olmalıdır.
NOT: "Pozitif Kontrol" (Positive Control) kuyusunun, testin doğru performansını kontrol etmekten başka bir amacı yoktur. "Pozitif Kontrol" kuyucuğunda liyofilize edilen materyal, "Hasta Testi" (Patient Test) kuyusundaki ile aynı değildir.

Test sonuçları:

• - Test doğru bir şekilde yapıldıysa, “DEA 1 Pozitif Kontrol'' olarak işaretlenmiş kuyuda görünür şekilde büyük aglütinasyon meydana gelmiş olmalıdır. Bakınız Şekil-1:
  
   
• - “Auto-Aglütinasyon Salin Ekranı” kuyucuğunda belirgin aglütinasyon varsa, bu hastada kesin bir sonuç elde etmek zor olacaktır. 3 oto-aglütinasyon reaksiyonu örneğini görmek için Bakınız Şekil-2, Şekil-3 ve Şekil-4:
  
• - "Oto-Aglütinasyon Salin Ekranı" kuyusunda oto-aglütinasyon yoksa ve "Patient Test" kuyusu büyük aglütinasyon gösteriyorsa, hasta DEA 1 pozitiftir. Görünür aglütinasyon yoksa, hasta DEA 1 negatiftir. 
  Negatif tepki örneğini görmek için bakınız Şekil-5:
  
• - 2 dakika sonra oluşan herhangi bir ince, granüler görünüm, sonuçların belirlenmesinde dikkate alınmamalıdır. DEA 1 pozitif bir hastanın aglütinasyon hızı ve hücre kümelerinin boyutu, "Positive Control" kuyusundakinden farklı olabilir. Tek bir hayvan, birden fazla birincil kan grubuna sahip olabilir. Böyle bir durumda, alyuvarlar bu tiplerin her biri için antijenler taşıyacaktır. Böyle bir hayvan, yalnızca DEA 1 antijenlerine sahip bir hayvandan daha az antijenik determinant taşıyacaktır.
   
• - Hasta çok anemik ise, aglütinasyon paterni, kaba aglütinasyondan ziyade her biri büyük bir toplu iğne başı gibi küçük kümeler şeklinde olabilir.